Stručná diskusia o chemickej syntéze oligonukleotidových liečiv a fosforových činidiel-CTPPA

(Phosphorus Reagents-CTPPA:2-Kyanoetyl N,N,N',N'-tetraizopropylfosforodiamidit CAS č.:102691-36-1)

Oblasť liekov na báze nukleových kyselín priťahuje v posledných rokoch značnú pozornosť. Schvaľovanie a uvádzanie liekov na báze nukleových kyselín sa urýchlilo a množstvo takýchto liekov s potenciálom stať sa trhákom zverejnilo klinické údaje, ktoré pokrývajú oblasti ako kardiovaskulárne a metabolické ochorenia, ochorenia pečene a rôzne zriedkavé ochorenia. V prvej polovici roku 2025 bolo na globálne uvedenie na trh schválených celkovo 22 malých liekov na báze nukleových kyselín (vrátane tých, ktoré už boli stiahnuté z trhu), pozostávajúcich z 13 liekov ASO, 7 liekov na báze siRNA a 2 liekov na báze ligandov -.

Z hľadiska klasifikácie majú najväčší podiel lieky ASO, pričom 13 predávaných liekov predstavuje 59,09 % z celkového počtu. Nasledujú lieky siRNA, pričom 7 predávaných liekov tvorí 31,81 %. Z hľadiska indikácie je 17 liekov zameraných na genetické zriedkavé ochorenia, 3 na očné ochorenia, 1 na kardiovaskulárne ochorenia a 1 na hematologické onkologické komplikácie. Distribúcia indikácií predstavuje vzorec „zriedkavých chorôb ako hlavného zamerania, s prelomovými úspechmi vo viacerých oblastiach“. Je evidentné, že klinická aplikácia liekov na báze malých nukleových kyselín sa postupne rozširuje za hranice zriedkavých chorôb do iných oblastí chorôb.

S rastúcim výskumom liekov na báze nukleových kyselín sa postupne budúcim trendom stane veľkovýroba rôznych oligonukleotidových liekov, medzi ktorými je chemická syntéza hlavnou metódou syntézy oligonukleotidov s krátkym-reťazcom. Metódy chemickej syntézy oligonukleotidov, ktoré prešli viac ako polstoročným vývojom, sa vyvinuli z počiatočnej fosfodiesterovej metódy na fosfotriesterovú metódu a fosfitovú metódu a potom na v súčasnosti zrelú fosforamiditovú metódu. Podobne ako pri syntéze peptidov, aj syntéza oligonukleotidov sa môže z iného pohľadu rozdeliť na syntézu v roztokovej -fáze a syntézu v tuhej -fáze. Tento článok predstavuje najbežnejšie používané "fosforové činidlá" a ich aplikácie pri syntéze nukleozidových monomérov.

Obrázok 1 Fosfitylačné činidlá a aktivačné činidlá

Pri syntéze oligonukleotidov je príprava nukleozidových monomérov nevyhnutným krokom. V súčasnosti existujú dve hlavné fosfitylačné činidlá široko používané na syntézu rôznych nukleozidových monomérov: jedným je 2-kyanoetyl-N,N-diizopropylchlórfosforamidit (1) [1]; druhým je bis(diizopropylamino)(2-kyanoetoxy)fosfín (2) (obrázok 1) [2]. 2-kyanoetyl-N,N-diizopropylchlórfosforamidit (1) vykazuje najvyššiu reaktivitu a ľahko kondenzuje s alkoholmi. Na rozdiel od toho bis(diizopropylamino)(2-kyanoetoxy)fosfín (2) vyžaduje aktiváciu in situ katalyzovanú slabo kyslými činidlami, ako je tetrazol, predtým, ako môže podstúpiť kondenzáciu s alkoholmi (obrázok 1). Z praktického hľadiska je 2-kyanoetyl-N,N-diizopropylchlórfosforamidit (1) drahší ako bis(diizopropylamino)(2-kyanoetoxy)fosfín (2). Vďaka svojej vysokej reaktivite je 2-kyanoetyl-N,N-diizopropylchlórfosforamidit (1) náchylnejší na degradáciu, čo znemožňuje jeho použitie a skladovanie. Tiež má tendenciu zavádzať ďalšie nečistoty počas reakcie, čo vedie k menej ideálnej čistote a výťažku. Preto je bis(diizopropylamino)(2-kyanoetoxy)fosfín (2) v súčasnosti bežnejšie používaným fosfitylačným činidlom pri príprave nukleozidových monomérov a často sa označuje skratkou "fosforové činidlo".

Obrázok 2 Mechanizmus reakcie tetrazolom-katalyzovanej fosfitylácie

V kondenzačnom procese medzi "fosforovými činidlami" a alkoholmi sa zvyčajne pridáva stechiometrické alebo sub{0}}stechiometrické množstvo aktivačného činidla. Medzi najčastejšie používané aktivačné činidlá patrí tetrazol, 4,5-dikyanimidazol a pyridíniumtrifluóracetát [3,4]. V súčasnosti je dôkladne študovaný mechanizmus kondenzačnej reakcie medzi „fosforovými činidlami“ a alkoholmi katalyzovanými tetrazolom [5-7].

Reakcia prebieha nasledovne: najprv "fosforové činidlo" podlieha protonácii; potom je diizopropylamín substituovaný tetrazolom; následne je tetrazol nahradený alkoholom (obrázok 2). Medzi týmito krokmi je rýchlosť-určujúcim krokom substitúcia diizopropylamínu tetrazolom.

Spomedzi troch vyššie uvedených aktivačných činidiel má tetrazol najsilnejšiu kyslosť (pKa=4.89) [3], ktorá je porovnateľná s kyslosťou kyseliny octovej (pKa=4.74). Naproti tomu 4,5-dikyanimidazol (pKa=5.20) [3] a pyridíniumtrifluóracetát (pKa=5.23) ​​[3] vykazujú slabšiu kyslosť.

Keďže 5'-hydroxylová skupina v nukleozidových monoméroch je typicky chránená kyslou -labilnou 4,4'-dimetoxytritylovou (DMT) skupinou, použitie tetrazolu môže byť sprevádzané vedľajšou reakciou deprotekcie DMT. Preto sú 4,5-dikyanoimidazol (pKa=5.20) a pyridíniumtrifluóracetát (pKa=5.23) niekedy ideálnejšou voľbou.

Okrem toho Koch a spol. uvádza, že keď sa ako aktivačné činidlo použije 4,5-dikyanoimidazol, úplná konverzia sa môže dosiahnuť iba s 0,7 ekvivalentmi činidla. Naopak, použitie viac ako 1 ekvivalentu je náchylné na tvorbu dimérnych vedľajších produktov [4].

Vlastnosti „Phosphorus Reagent-CTPPA“

"Phosphorus reagent" je bezfarebná alebo svetložltá kvapalina s relatívne vysokým bodom varu (115 stupňov / 0,6 Torr). Je citlivý na kyslík aj vlhkosť a má tendenciu ľahko sa degradovať počas vákuovej destilácie, čo sťažuje-výrobu tohto produktu vo veľkom meradle. Medzitým vzhľadom na jeho špeciálne vlastnosti predstavuje kontrola kvality fosforového činidla tiež značné ťažkosti. Pre používateľov by sa malo činidlo po každom použití chrániť dusíkom a uchovávať v exsikátore. Tento postup môže predĺžiť životnosť činidla.

Naša spoločnosť sa zaoberá výskumom, vývojom a výrobou fosforových činidiel už takmer desaťročie, pričom nazbierala rozsiahle skúsenosti s výrobou a testovaním produktu. V súčasnosti môžeme dodať -činidlo na fosfor s vysokou čistotou v kilogramovej váhe. Okrem toho poskytujeme aj súvisiace produkty, ako je tetrazol a 4,5-dikyanoimidazol. Uvítame priateľov s relevantnými potrebami, aby nás kontaktovali (tabuľka 1).

Tabuľka 1 Príslušné produkty vyrábané a predávané našou spoločnosťou

Referencie

[1] Sinha, ND; McManus, J.; Köster, H. Nucleic Acids Research 1984, 12, 4539.

[2] Nielsen, J.; Taagaard, M.; Marugg, JE a kol. Nucleic Acids Research 1986, 14, 7391.

[3] Sanghvi, YS; Guo, Z.; Pfundheller, HM, a kol. Organic Process Research Development 2000, 4, 175.

[4] Pedersen DS; Rosenbohm C.; Koch T. Synthesis 2002, 802.

[5] Nurminen, EJ; Mattinen, JK; Lönnberg, H. Journal of Chemical Society, Perkin Transactions 2, 1998, 162.

[6] Berner, S.; Mühlegger, K.; Seliger, H. Nucleic Acids Research 1989, 17, 853.

[7] Dahl, BM; Nielsen, J.; Dahl, O. Nucleic Acids Research 1987, 15, 1729.